CRISPR功能研究入門指南(CRISPRi)

【字體: 時間:2016年03月03日 來源:生物通

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  The Scientist雜志聯合CRISPR的開發者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南,幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

生物通報道:基因組測序讓我們意識到,人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質。其實我們基因組的80%會轉錄成RNA,但這些轉錄本大多不生成蛋白質。近年來人們發現非編碼RNA往往與人類疾病有關,不過絕大多數非編碼RNA的功能還是未知的。

CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。這一系統原本是細菌在漫長進化史中演化出的防御機制,能根據引導RNA的指示,靶標并降解入侵者的遺傳物質。規律成簇的間隔短回文重復CRISPR與內切酶Cas9的組合,可以在引導RNA的指引下,靶標并切割入侵者的遺傳物質。2012年研究者們利用這一特點,將CRISPR系統發展成了強大的基因組編輯工具。

CRISPR/Cas9很快迎來了進一步的改造。研究者們將Cas9帶到特定的基因組位點,通過起始或停止轉錄來調控靶基因的表達。CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR抑制(CRISPRi)就是這樣的技術,它們特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi,但它們其實還剛出爐不久。“我們都是這些技術的測試員,”加州大學的Jacob Corn說。

為此,The Scientist雜志聯合CRISPR的開發者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南,幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

CRISPRi

CRISPRi技術能抑制指定目標的轉錄,不論是編碼還是非編碼的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9(dCas9),dCas9能到達引導RNA指定的位點,但無力對DNA進行剪切(Cell, 152:1173-83, 2013)。當dCas9結合到基因組的時候,會阻斷轉錄機器的結合,阻止這一過程的進行。

改良版CRISPRi在dCas9上連接了一個來自轉錄沉默子(KRAB)的結構域。這個大約50aa的添加阻礙了DNA伸展,使其難以得到轉錄。“KRAB結構域的使用目前效果很好,”Corn說。牛津大學的Andrew Bassett也同意這一看法,他認為剛開始接觸CRISPRi的新手應該優先考慮KRAB。雖然它作用于比較大的位點,但抑制效果也更強,更容易被我們觀察到。

CRISPRi的可逆性是一種特色,不過這也限制了該技術的應用。一些研究者正在利用KRAB結構域讓dCas9結合得更加穩定,以實現永久抑制特定位點的轉錄。人們可以通過這種方法研究表觀遺傳學標記的跨代遺傳,Corn指出。

RNAi VS CRISPRi

研究基因功能最常見的方法是,減少或者阻斷基因表達,然后進行表型分析。十多年來,RNAi一直是這一領域的王者,然而新興技術的涌現(尤其是CRISPR技術)正在逐漸瓦解RNAi的統治地位。日新月異的技術發展為生物學研究提供了越來越大的助力,也給研究者們帶來了一個有些糾結的問題,“到底應該選擇那一種技術呢”。

RNA干擾(RNAi)靶標成熟的RNA,而CRISPRi阻止轉錄的起始。如果你的研究核心是轉錄活動而不是RNA產物,那么CRISPRi更有優勢。此外CRISPRi還可以靶標細胞核內的轉錄本,RNAi試劑則很難做到這一點。

RNAi的脫靶效應一直令人擔憂。雖然CRISPR系統也存在脫靶效應,但要比RNAi少得多,因為CRISPRi必須在轉錄起始位點附近才能發揮作用。目前我們對RNAi的問題更為了解,Corn說,因此他的研究團隊仍在使用RNAi。不過Corn相信RNAi未來難免會江河日下。

未完待續

Molecular Cell雜志技術特刊的一篇文章對RNAi、TALEN和CRISPR這三大工具進行了全面比較,為基因功能研究提供了一份實用指南。研究者們可以根據自己的需要,簡單直觀的找到最適合自己的技術。現在這篇文章可以免費下載(更多詳細信息參見:CRISPR、RNAi、TALEN一張圖教你做出正確選擇

RNAi比較容易出現錯誤,siRNA/shRNA的脫靶效應會引起假陽性結果,siRNA/shRNA缺乏活性會引起假陰性結果。此前,加州大學舊金山分校的研究團隊通過建立超復雜混合shRNA文庫(ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries),在很大程度上克服了RNAi用于全基因組篩選時的脫靶效應。現在他們通過系統改良進一步增強了shRNA的活性,向人們展示了靶標人類和小鼠基因組的新一代shRNA文庫。(更多詳細信息參見:與CRISPR旗鼓相當的新一代RNAi

CRISPR-Cas9在醫療領域有著廣闊的前景,可以用來矯正致病突變,治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術操縱生態群體,比如根據毒力或者抗性基因殺死相應的細菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農作物等等。此外,CRISPR-Cas9還有著很大的潛力,可以被改造為更強大的研究工具。加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Molecular Cell雜志上發表文章,全面探討了CRISPR-Cas9在各方面的應用。Doudna是CRISPR技術的共同開發者,曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”(Breakthrough Prize),也是CRISPR專利的有力競爭者。(更多詳細信息參見:CRISPR只是基因組編輯?你已經OUT了

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